Monodiscos Britania
Presentación
Tubos conteniendo 50 monodiscosPrueba de sensibilidad a los antimicrobianos
Técnica (adaptada de Bauer, Kirby y cols).
1. Preparación de las placas con el medio de cultivo:
a) Medio: el medio a utilizar es el agar Müeller-Hinton (no debe emplearse otro medio). Debe controlarse que el pH del mismo se encuentre entre 7.2 y 7.4.
b) Volumen del medio por placa: debe verterse 25 a 30 ml de agar fundido y enfriado a 50-55°C en placas estériles de vidrio o plástico (BRISTERIL-PLAK) de modo de obtener una capa de 4 mm de alto. Es fundamental respetar esta condición, pues de lo contrario, se obtendrán halos mayores o menores según el caso.
c) Secado de las placas: para eliminar la humedad sobre la superficie del medio, las placas deben secarse incubándolas a 35-37 °C durante 30-60 minutos (pueden conservarse hasta 4 días las placas preparadas, refrigeradas a 4-8 °C).
d) Condiciones de los cultivos originales: es necesario que el antibiograma se realice a partir de cultivos monomicrobianos o, cuando menos, con colonias bien separadas del mismo aspecto, de la placa de aislamiento. No tiene sentido efectuar antibiogramas con materiales directos que segura o potencialmente contengan flora plurimicrobiana (exudados faríngeos, nasales, orina, heces, etc.). Debe tenerse en cuenta que el método de Bauer y Kirby se aplica a bacilos Gram negativos de fácil desarrollo (Enterobacteriaceae, Pseudomonas, etc.) y Staphylococus o Enterococus, no pudiendo ser utilizado sin modificaciones para determinar la susceptibilidad in vitro frente a otros gérmenes. La pruebas de difusión por el método de los discos para H. influenzae, N. gonorrhoeae y S. pneumoniae se deben realizar de acuerdo a las normas NCCLS vol. 17 N° 1 (1997). Document M2-A6. Otras bacterias "fastidiosas" pueden ser ensayadas por el método de dilución (documento M7-A4 / 1997).
e) Preparación del inóculo: se toman de 3 a 5 colonias del cultivo original con un asa de nichrome y se introducen en 5 ml de Caldo Tripteína soja. Si la suspensión obtenida tiene una turbidez superior o similar a la del testigo, no es necesaria una incubación ulterior. De lo contrario, los tubos se incuban a 35-37°C hasta lograrse la turbidez requerida. En ambos casos si es necesario, diluir para equiparar la suspensión a la del testigo; puede utilizarse para ello, caldo o solución salina. Testigo: 0.5 ml de Cl2Ba 0.048 M (1.175% p/v Cl2Ba 2H20) a 99.5 ml de SO4H2 0.36 N (1% v/v).
f) Siembra en placas: la suspensión bacteriana obtenida como se indica en el punto e), es absorbida con un hisopo de algodón SWABRIT (no debe usarse asa metálica ni varilla de vidrio). El exceso de líquido se descarta oprimiendo el algodón contra la pared del tubo. Para inocular las placas, se aplica el hisopo sobre la superficie de las mismas, efectuando estrías en direcciones diferentes. Se dejan secar las placas durante unos cinco minutos antes de proceder a aplicar los discos.
g) Condiciones de los discos: es necesario asegurarse que los discos que se emplean, reúnan las siguientes condiciones: 1) que tengan 6 mm de diámetro; 2) que no hayan expirado en su fecha de vencimiento; 3) que se encuentren convenientemente refrigerados y protegidos de un exceso de humedad. Los discos que contienen antibióticos de las familias de las penicilinas (por ej. penicilina, ampicilina, carbenicilina, ticarcilina, mezlocilina, piperacilina) y cefalosporinas (por ej. cefalotina, cefotaxima, cefuroxima, ceftazidima, etc.) deben conservarse a -20°C o menor temperatura para mantener su potencia, excepto la pequeña cantidad necesaria para el trabajo semanal que puede mantenerse refrigerada en la heladera. Es de fundamental importancia tener en cuenta, que este método solamente tiene valor si se respeta una distancia que separe los discos, suficiente para limitar las probabilidades de superposición importante de zonas de inhibición. Por consiguiente, pueden aplicarse SOLAMENTE 9 DISCOS EN UNA PLACA CONVENCIONAL DE 100 mm (la usada comúnmente en nuestro medio) o bien 9 discos externos y 3 internos en una placa grande de 150 mm. No es conveniente exceder el número máximo de discos por placa ya que, de lo contrario, los halos correspondientes a la inhibición provocada por antibióticos, pueden interferir con los de los discos vecinos, pudiendo ocurrir tanto sinergismos como antagonismos que no corresponden a la realidad. En consecuencia, los "discos múltiples en ruedas" que exceden el número de 9 discos para placas comunes de 100 mm resultan inadecuados.
h) Aplicación de los discos: se aplican los discos sobre la superficie del agar por medio de una pinza. Se debe tener el cuidado, que los discos hagan buen contacto con la superficie del agar, ejerciendo para ello, ligera presión sobre los mismos. Transcurridos 30 minutos de la colocación de los discos, las placas se incuban invertidas en la estufa a 35-37°C durante toda la noche (18 hs).
i) Medidas de las zonas de inhibición: no deben efectuarse lecturas de los antibiogramas basándose en la sola consideración de la presencia o la ausencia del halo de inhibición. En todos los casos deben tomarse en cuenta, los diámetros de los halos, ya que éstos varían según la difusibilidad del antibiótico. Así, un halo pequeño (12 mm) para la colistina, antibiótico poco difusible, representa sensibilidad, en tanto que ese mismo diámetro para el cloranfenicol, indica resistencia. Para medir los halos debe emplearse un calibre o una reglilla. La lectura se hace a ojo desnudo midiendo el diámetro total del halo incluyendo el disco. De tal manera, la ausencia total de inhibición es el borde del disco, es decir 6 mm de lectura. Cuando se leen los resultados en cepas que crecen con el desarrollo invasor (Proteus mirabilis o vulgaris), hay que tomar la precaución de ignorar el ligero velo de crecimiento, diseminante, midiendo para ello el halo a partir de donde se detiene el desarrollo confluente. Algunos antibióticos inhiben el desarrollo invasor y otros no lo hacen.
j) Significado de las colonias que aparecen dentro de los halos: cuando aparecen colonias aisladas dentro del halo de varios antibióticos con diferente mecanismo de acción (por ej., cloranfenicol, fosfomicina y gentamicina) ello generalmente corresponde a cultivos impuros, consecuentes a fallas en el aislamiento. Si se comprueba que efectivamente se trata de una mezcla, deben efectuarse antibiogramas por separado para cada una de ellas. Si la presencia de colonias dentro de los halos ocurre alrededor de los discos de un solo antibiótico o de antibióticos muy relacionados (por ej., penicilina y ampicilina) ello suele obedecer a la existencia de bacterias previamente resistentes en la población usada como inóculo. La prudencia aconseja interpretar tales casos como resistencia y sugerir la determinación de una concentración inhibitoria o bactericida mínima para el caso en que se desee administrar el antibiótico en cuestión.
k) Interpretación de los resultados: conocidos los diámetros para cada antimicrobiano ensayado, puede concluirse que el germen es sensible, de sensibilidad intermedia o resistente, de acuerdo a la tabla publicada por N.C.C.L.S. M2-A6 Vol. 17 N° 1 (1997). Para los antibióticos introducidos luego de la aparición de la publicación mencionada, deben consultarse trabajos en los que se haya respetado la metodología de los autores y en los que se efectuaron determinaciones de la concentración inhibitoria mínima y establecidas convenientemente las curvas de regresión.
l) Control: es conveniente utilizar quincenalmente controles, con cepas, para las cuales los halos de inhibición son conocidos, lo que permite evaluar la calidad de los medios de cultivo, discos (incluida su conservación) y la metodología utilizada. Dichas cepas son E. coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. El contenido de timidina del medio de Müeller-Hinton debe controlarse con discos de TMS frente a Enterococcus faecalis ATCC 29212.
Importante
La categoría intermedia debe ser informada. Las concentraciones inhibitorias mínimas (CIM) para estos casos, se aproximan a los que se obtienen en niveles sanguíneos y tisulares y las respuestas, pueden ser bajas para las cepas aisladas. La categoría intermedia, implica aplicación clínica en sitios donde los antimicrobianos se concentran (por ej.: quinolonas y betalactámicos en orina) o cuando se pueden usar altas concentraciones del antibiótico (por ej.: betalactámicos). La categoría intermedia también indica una zona buffer o reguladora, que suele prevenir algunos factores técnicos de descontrol que causarían discrepancias en la interpretación, especialmente cuando las drogas tienen un estrecho margen de farmacotoxicidad.Criterios de interpretación basados en el método de Kirby-Bauer de Pruebas de Sensibilidad para organismos de fácil crecimiento
en mm
< ó =
> ó =
Observaciones
1) Las zonas de inhibición obtenidas con aminoglucósidos, particularmente cuando se ensaya P. aeruginosa dependen del contenido de cationes divalentes del medio de cultivo. Estos estándares de interpretación sólo deben ser usados con agar de Müeller-Hinton cuya eficacia haya sido aprobada previamente con la cepa control de P. aeruginosa ATCC 27853. Los organismos que entran en la categoría de sensibilidad intermedia, pueden ser sensibles o resistentes cuando se ensaya por métodos de dilución y deberán ser clasificados por lo tanto, como de sensibilidad "indeterminada".
2) El criterio de interpretación para ampicilina, también debe ser usado para interpretación de ampicilina + sulbactama y amoxicilina + ácido clavulánico, cuando se ensayan enterococos, estreptococos no enterococos y otras bacterias Gram positivas.
3) Las cepas resistentes de S. aureus producen beta lactamasa y el ensayo debe realizarse preferiblemente con el disco de 10 U de penicilina G. La penicilina G debe usarse para ensayar la sensibilidad de todas las penicilinas susceptibles a la penicilinasa, tales como: ampicilina, amoxicilina, azlocilina, bacampicilina, hetacilina, carbenicilina, mezlocilina, piperacilina y ticarcilina. Los resultados pueden aplicarse a fenoximetilpenicilina o feniticilina.
4) El disco de ampicilina representa además a amoxicilina, bacampicilina, ciclacilina y hetacilina.
5) Cuando un enterococo, entra en la categoría de sensible para penicilina o ampicilina, implica la necesidad de realizar la terapia de altas dosis para las infecciones graves por este microorganismo. La endocarditis, por ejemplo, requiere terapia combinada con altas dosis de penicilina o ampicilina o teicoplanina o vancomicina más gentamicina o estreptomicina, para tener acción bactericida. La detección de la resistencia a penicilina o ampicilina en cepas de enterococos, debida a la producción de betalactamasas no es posible usando una concentración de inóculo similar a la recomendada para la prueba rutinaria de difusión o dilución. Se usa la técnica de nitrocefin con un inóculo cargado con la colonia directamente. La sinergia entre ampicilina y penicilina y un aminoglucósido, se realiza mejor evaluando la sensibilidad a 500 o 2000 ug de gentamicina o 2000 ug de estreptomicina por ml. Los casos aislados de infecciones urinarias, deben ser considerados sensibles a ampicilina solamente.
6) Las infecciones por Pseudomonas aeruginosa en pacientes granulocitopénicos e infecciones severas en otros pacientes, deben ser tratadas con el máximo de dosis de penicilinas selecciondas por su actividad antipseudomonas (carboxi o acilaminopenicilinas o ceftazidima) en combinación con un aminoglucósido.
7) El disco de 30 ug de cefazolina no es adecuado para predecir la sensibilidad de otras cefalosporinas de primera generación. El disco representativo es el de cefalotina 30 ug que representa además a cefapirina, cefradina, cefalexina y cefadroxilo. Según NCCLS representa también a cefaclor (excepto para Haemophilus). Para algunos investigadores, cefaclor es de segunda generación y su actividad difiere y es superior a cefalotina especialmemnte en infecciones urinarias; por tal motivo ha sido incluido en el discograma de IU ambulatoria.
8) Si las cepas de S. aureus muestran resistencia a una de las penicilinas resistentes a la penicilinasa (MRSA) como meticilina u oxacilina, debe informarse resistente a cefalosporinas y a otros beta-lactámicos nuevos como imipenem, ampicilina o amoxicilina asociados a inhibidores de betalactamasa, etc., independientemente del resultado obtenido in vitro. Esto es debido a que en la mayoría de los casos documentados de infecciones causadas por S. aureus meticilina resistente, el paciente responde mal a la terapia cefalosporínica o todavía existe falta de confirmaciones de la eficacia clínica de las combinaciones con ácido clavulánico o sulbactama y con imipenem. Staphylococcus spp. coagulasa negativo, meticilina resistente, también parecen responder mal a las anteriores drogas citadas.
9) Tetraciclina es la clase de disco para todas las tetraciclinas y los resultados pueden ser aplicados a clortetraciclina, demeclociclina, doxicilina, metaciclina, minociclina y oxitetraciclina. Sin embargo, ciertos organismos son más sensibles a doxicilina, y minociclina (algunos estafilococos y Acinetobacter).
10) Debe usarse oxacilina como droga clase de penicilinas antiestafilocócicas resistentes a la betalactamasa, debido a que es más resistente a la degradación durante su conservación y puede ser aplicada para evaluar la sensibilidad de neumococos y además para detectar más fácilmente las cepas heterorresistentes. Los resultados con el disco de oxacilina pueden extenderse a meticilina, cloxacilina y dicloxacilina (esta última es la única que se comercializa en Argentina). No debe usarse disco de cloxacilina pues no detecta bien las cepas de S. aureus meticilino resistentes. Cuando se obtiene un resultado de ÒintermedioÓ con estafilococos, las cepas deben ser investigadas para detectar si hay heterorresistencia.
11) El disco de clindamicina se usa para ensayar sensibilidad a clindamicina y lincomicina.
12) El disco de sulfisoxazol puede ser usado para cualquiera de las sulfonamidas disponibles comercialmente. Los medios que contienen sangre, excepto los que contienen sangre de caballo lisada, no son adecuados para ensayar sulfonamidas. El agar de Müeller-Hinton debe estar libre de timidina para evaluar a sulfonamidas y/o trimetoprima. La efectividad del agar de Müeller-Hinton para el ensayo de TMS debe controlarse con la cepa de Enterococcus faecalis ATCC 29212. Una zona de inhibición de > 20 mm libre de pequeñas colonias, indica niveles bajos o nulos de timina y timidina.
13) Los datos de la prueba de sensibilidad para cinoxacina, ácido nalidíxico, nitrofurantoína, norfloxacina y sulfonamidas, se aplica sólo a microorganismos aislados de infecciones urinarias.
14) Los métodos de rutina descriptos para patógenos de rápido crecimiento, no son generalmente aceptados para organismos de difícil crecimiento: Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae y Streptococcus pneumoniae. Para evaluar estos microorganismos, deben consultarse los métodos descriptos en el Manual del NCCLS Vol. 17 N° 1 Documento M2-A6 (enero 1997).
15) La confirmación de la resistencia intrínseca a la oxacilina puede efectuarse inoculando el microorganismo en una placa de agar Müeller-Hinton suplementada con 4% de cloruro de sodio y 6 µg/ml de oxacilina. Se inocula el agar en un cuadrante o con un toque Òspot testÓ usando un hisopo que se ha sumergido en una suspensión equivalente al estándar 0.5 de Mc Farland y del cual ha sido eliminado el exceso de líquido. Se debe incubar 24 hs. a 35°C y leer para verificar la presencia de algún desarrollo; el crecimiento implica resistencia intrínseca a la oxacilina. Este método ha sido usado extensivamente con S. aureus pero la experiencia con estafilococos coagulasa negativo, ha sido similar.
16) De las ureidopenicilinas presentes en nuestro país, piperacilina es la de mayor actividad. Este tipo de antimicrobianos, sufren un considerable "efecto inóculo", o sea que si se aumenta la concentración del inóculo, aumenta en forma desproporcionada la CIM, la que se traduce en halos dentro del rango de resistencia, o ausencia de halos en cepas previamente sensibles. Este efecto se atribuye a la inestabilidad de las drogas frente a altas concentraciones de betalactamasas.
17) El disco de cefotaxima representa al grupo de antimicrobianos conocidos como aminotiazolmetoximinocefalosporinas y si bien el disco contiene la de primera aparición en el mercado, de ninguna manera debe suponerse que implica preferencia por este antimicrobiano y el informe al médico, debe indicar el mismo resultado para cefotaxima, ceftizoxima y ceftriaxona. Estos antimicrobianos son poco efectivos frente a Pseudomonas aeruginosa y a diferencia de lo que ocurre con enterobacterias, las CBM suelen ser superiores a la CIM, por lo que se sugiere consignar como sensibles, aquellas cepas que entren de lleno en el rango de sensibilidad. La actividad in vitro de cefotaxima, ceftizoxima y ceftriaxona son análogas; las diferencias en la CIM son mínimas o inexistentes, cuando se presentan, no suelen superar el valor de una dilución y por ende, los diámetros de los halos de inhibición por el método de los discos son superponibles. Tales drogas difieren únicamente en sus propiedades farmacocinéticas.
18) Ceftazidima es una carboxipropiloximinocefalosporina y presenta frente a enterobacterias, la misma actividad que los aminotiazolmetoximinocefalosporinas; sin embargo, es considerablemente más activa frente a Pseudomonas aeruginosa.
19) Cefoperazona es menos activa que las restantes cefalosporinas de tercera generación sobre varias enterobacterias, particularmente Klebsiella debido a su mayor labilidad a las enzimas plasmídicas TEM y SHV. Tiene buena actividad sobre Pseudomonas aeruginosa.
20) Cefixima tiene una actividad semejante, pero no igual a cefotaxima y tiene la ventaja de su administración oral.
21) La actividad de eritromicina es equivalente a la de roxitromicina.
22) La difusión en agar de la colistina y de la polimixina B es deficiente, por lo que la precisión del método de difusión es menor que en el caso de otros antibióticos. En los casos necesarios conviene confirmar los resultados de la prueba de difusión por un método de dilución.
23) La presencia de rifampicina en la serie para evaluar la sensibilidad a estafilococos es con la concentración indicada (disco 5 ug) en normas NCCLS. Para evaluar la sensibilidad frente a bacilos Gram negativos, se debe usar un disco de 30 ug de acuerdo a las normas de la Sociedad Francesa de Microbiología.
24) El disco de fosfomicina lleva incluido 50 ug de glucosa 6-fosfato.
25) La carga de los discos se basa en las recomendaciones del informe técnico de la OMS N° 673, en el informe NCCLS y en trabajos científicos de investigadores argentinos y extranjeros.
26) Los resultados de gentamicina, pueden extenderse a sisomicina; los de ácido nalidíxico a ácido oxolínico; los de colistina a polimixina B y los de ticarcilina a carbenicilina.
27) Cuando se ensaya vancomicina frente a enterococos, la lectura debe realizarse a las 24 hs. y examinada con luz transmitida; la presencia de algún desarrollo o invasión dentro de la zona de inhibición, indica resistencia. Si se considera que debe efectuarse tratamiento con vancomicina en infecciones graves por enterococo y los resultados dan en zona intermedia, debe determinarse la concentración inhibitoria mínima.
28) Existen cepas de Klebsiella spp. y Escherichia coli productoras de Beta lactamasa de expectro extendido que a pesar de su aparente sensibilidad in vitro son clínicamente resistentes a cefalosporinas y aztreonam. Algunas de estas cepas pueden ser reconocidas por dar resultados "intermedio" o "resistente" en ceftazidima o aztreonam (y también a veces a cefotaxima, ceftriaxona y ceftizoxima) y a menudo son resistentes a otros agentes tales como aminoglucósidos y trimetoprima-sulfametoxazol. SADEBAC hace varios años ha alertado sobre la aparición de estas cepas en nuestro país y aconseja considerar como resistentes aquellas cepas de Escherichia coli y Klebsiella spp. con diámetro de halo < o = 25 mm para cefalosporinas de tercera generación. Es frecuente que estas cepas sean simultáneamente sensibles a cefoxitina e imipenem excepto raras mutantes de permeabilidad.
29) La Subcomisión de Antimicrobianos de SADEBAC luego de haber realizado un trabajo prospectivo multicéntrico, sugiere, que debido a la alta resistencia de las cepas de E. coli frente a la ampicilina en nuestro país los criterios de interpretación de la prueba de difusión en agar para AMS frente a E. coli deben ser los siguientes:
AMS= ampicilina + sulbactama sódica