CHROMOBRIT®
Los cromógenos de la nueva generación


Introducción

La identificación bacteriana se basa generalmente, en una extensa batería de pruebas bioquímicas convencionales, que permiten determinar sus características de desarrollo y su metabolismo.
Estos métodos requieren una colonia bacteriana pura, tomada de una placa de aislamiento primario, su siembra en diferentes medios y su posterior lectura e interpretación. En la mayoría de los casos, el diagnóstico lleva tiempo y varios pasos de manipulación.
Hace pocos años se ha comenzado a utilizar sustratos enzimáticos sintéticos, en la identificación de microorganismos capaces de detectar por medio de la formación de color, la presencia de enzimas especificas de especie.
En general, se distinguen varios grupos de compuestos cromogénicos que han sido usados en reacciones bioquímicas para estudiar la cinética de enzimas específicas, de acuerdo al principio, que el sustrato es hidrolizado por la enzima especifica, liberando un cromóforo.
Los sustratos enzimáticos cromogénicos, son en parte, compuestos fenol derivados tales como orto y para nitrofenoles, para-nitro-anilina, indolil derivados: 5 bromo-4 cloro-3 indolil, 5 bromo-6 cloro-3 indolil (magenta), 6 cloro-3 indolil (salmón).
Muchos de estos sustratos, se pueden incorporar a los medios de cultivo para una identificación rápida y precisa. Varios investigadores combinan estos sustratos con medios selectivos y diferenciales.
El objetivo, es que este tipo de sustratos enzimáticos incorporados en un medio selectivo, pueda eliminar la necesidad del subcultivo y la realización de numerosas pruebas bioquímicas, economizando tiempo y dinero.
Las interacciones entre los microorganismos y las sustancias químicas, difieren y dependen de la estructura de los cromógenos usados y de las enzimas detectadas.
La sustancia generada durante la reacción enzimática, se precipita sobre las células microbianas dando características cromogénicas específicas a las colonias.

Aplicación de las pruebas enzimáticas

La detección y recuento de bacterias indicadoras de contaminación, es de importancia primaria en el control de calidad de aguas y alimentos. En particular, coliformes y E. coli, se usan como indicadores de polución fecal.
Las bacterias coliformes y E. coli en aguas y alimentos, generalmente se detectan usando la técnica de filtración por membrana (FM), la técnica del número mas probable (NMP), o usando el ensayo de la presencia / ausencia de coliformes (P/A), prueba presuntiva que debe continuarse con una prueba de confirmación.
El criterio más importante usado durante el recuento de bacterias coliformes, es la fermentación de lactosa.
La ruptura del disacárido, es catalizada por la enzima ß-D-galactosidasa.
Las pruebas para fermentación de lactosa usan las propiedades de producción de gas y ácido. Este método requiere varios días cuando da positivo y se deben realizar las pruebas de confirmación de las bacterias aisladas.

Escherichia coli
La ß-D-glucuronidasa (GUD) es una enzima que cataliza la hidrólisis de ácidos ß-D glucopiranosidúricos en sus correspondientes agliconas y ácido glucurónico.
Laboratorios Britania, ha aprovechado este principio cuando desarrolló hace años su producto Colibritania con PNPG (B1240524).
Numerosos autores, han demostrado que aproximadamente entre el 94 – 96 % de cepas de E. coli y solo unas pocas de Salmonella, Shigella y Yersinia producen esta enzima.
Cabe aclarar que algunas cepas patógenas de E. coli como E. coli H7O157, no poseen GUD y otras Escherichia spp no producen esta enzima.
La actividad de ß-D glucuronidasa (GUD) se puede medir usando varios sustratos cromogénicos.
Ejemplos en medios líquidos y sólidos incluyen:

que danel p-nitrofenol (amarillo), el azul indoxilo y magenta, respectivamente.

Bacterias coliformes

La ß-D galactosidasa es la enzima utilizada como marcador para coliformes y puede ser detectada, usando sustratos tales como O-nitrofenil ß-D galactopiranósido (ONPG Britania B1240127), 5 bromo-4 cloro-3 indolil ß-D galactopiranósido (X-GAL), 5 bromo-6 cloro-3 indolil ß-D galactopiranósido (Mag-Gal).
Por lo tanto, es posible preparar medios para la detección simultánea de coliformes totales y E. coli en aguas y alimentos.
En medio sólido, se observa que el producto final coloreado de la ruptura del ONPG, difunde extensivamente en el medio de cultivo.
Por tal motivo, X-Gal o Mag-Gal en medios sólidos, son efectivos para detectar la actividad ß-D galactosidasa porque precipitan sobre las colonias en formación.

CHROMOBRIT® c.c.

Para la búsqueda de E. coli y coliformes en aguas y alimentos

Laboratorios Britania ha desarrollado un medio sólido que contiene los sustratos cromogénicos 5 bromo-4 cloro-3 indolil ß-D glucurónido (X-GUD) y 5 bromo-6 cloro-3 indolil ß-D galactopiranósido (Magenta Gal) y el activador IPTG (Isopropil ß-D tiogalactopiranósido).
El crecimiento de coliformes, aún de las células dañadas, esta garantizado por la composición del medio de cultivo que contiene tripteína (hidrolizado pancreático de caseína), extracto de levadura, piruvato de sodio, peptona de soya y fosfatos.
Las bacterias Gram positivas, son inhibidas por la presencia de lauril sulfato de sodio.
Sobre este medio de cultivo, las colonias de Escherichia coli crecen favorablemente y son detectadas por la aparición de un color azul o azul oscuro a violeta en el centro de la colonia, producido por la ruptura del X-glucurónido a partir de la ß-D glucuronidasa.
Las bacterias del grupo que no poseen ß glucuronidasa como la E. coli H7O157 crecen con centro rosado-rojizo (ya que sí tienen presente la enzima Gal como todos los coliformes).
Los coliformes totales (Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter), crecen dando colonias con centro rosado-rojizo por la ruptura del sustrato magenta-Gal por la acción de la ß galactosidasa.
Las bacterias no fermentadoras de lactosa (Proteus spp, Salmonella spp, Shigella spp) dan colonias blancas.
Los estafilococos y enterococos están inhibidos.
Como el medio de cultivo base, contiene triptofano, se puede realizar la prueba de indol, lo que incrementa el valor presuntivo del hallazgo de E. coli.

Fórmula (en gramos por litro)

Instrucciones

Tripteína

10.0

Fundir los frascos del medio sólido en un Baño Maria a ebullición.

Distribuir aproximadamente 15 ml por placa. El medio de cultivo en las placas es ligeramente opalescente.

Guardar en heladera al abrigo de la luz.

Piruvato de sodio

1.0

Peptona de soya

5.0

Nitrato de potasio

1.0

L-triptofano

1.0

Lauril sulfato de sodio

0.2

Fosfato dipotásico

2.5

Extracto de levadura

5.0

Agar

15.0

X-GUD

0.1

Magenta GAL

0.1

IPTG

0.1

pH final: 7.1 ± 0.2

Inoculación de muestras

Sembrar las muestras en superficie o por la técnica del pour - plate.
Incubar 24 h a 35 – 37ºC

Resultados

Microorganismo

Características de las colonias

E. coli

Colonias azul oscuro a violeta

Coliformes

Colonias rosadas a rojizo

Otras bacterias Gram Negativas

Colonias blancas o incoloras

IMPORTANTE

La detección de beta triptofanasa (prueba del indol), realizada con reactivo para dimetil amino cinamaldehído, aumenta la sensibilidad del método para detectar E. coli.
Para la reacción, pasar una colonia a papel de filtro y agregar una gota del reactivo.
La aparición de un color azul, dentro de los treinta segundos, indica la positividad de la prueba.
Según la literatura entre el 94/96% de E. coli, posee la enzima ß -glucuronidasa.
Escherichia coli H7O157 es ß glucuronidasa (-), indol (+).

CONTROL DE CALIDAD

Microorganismo

Características de las colonias

ß-glucuronidasa

ß-galactosidasa

Indol

E. coli ATCC 25922

Colonias con centro azul oscuro a violeta.

+

+

+

E. coli ATCC 35218

Colonias con centro azul oscuro a violeta.

+

+

+

E. coli H7O157 ATCC 700728

Colonias con centro rosado rojizo

-

+

+

Klebsiella pneumoniae ATCC 700603

Colonias con centro rosado rojizo.

-

+

  

Citrobacter freundii

Colonias con centro rojizo.

-

+

  

Proteus mirabilis ATCC 43071

Colonias blancas.

-

-

  

Morganella morganii

Colonias blancas.

-

-

  

Salmonella typhimurium ATCC 14028

Colonias blancas.

-

-

  

Salmonella enteritidis

Colonias blancas.

-

-

  

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Colonias blancas.

-

-

  

Shigella flexneri. ATCC 12022

Colonias blancas.

-

-

  

Staphylococcus aureus ATCC 25923

Inhibido.

-

-

  

Enterococcus faecalis ATCC 29212

Inhibido.

-

-

  

Observaciones

Almacenamiento

Conservar a 10-35 °C.

Presentación 

6 x 50 ml *

B04-214-84

12 x 100 ml *

B04-214-92

* Incluye Reactivo cinamaldehído